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Index
Date: 26/Feb/2025
Objective: bufferの準備をする。
Protocol:
| MnCl2・4H2O | 5.44g |
| CaCl2・h2O | 1.10g |
| KCl | 9.325g |
| MilliQ | up to 480ml |
上記水溶液をオートクレーブした。
オートクレーブ済みの水溶液をBuffer①とする。
7.55gのPIPESを40mlのMilliQ水で溶かした。
5M KOHでpH6.7に調整した。
MilliQ水で50mlまでメスアップした。
クリーンベンチ内でろ過滅菌した。
ろ過滅菌後の水溶液をBuffer②とした。
Buffer①と②は使用直前で混ぜるため別々に保管した。
Result: Bufferの調製が完了した。
Date: 25/Mar/2024
Objective: LB培地を作製する。
Protocol: “LB培地の作製”を参照。
Result: 操作が無事に完了した。
Date: 25/Mar/2024
Objective: JM109のコロニーを単離する。
Protocol:
JM109のコンピテントセルをごく少量とり、抗生物質を含まない固体のLB培地へ塗布した。
37℃で一晩インキュベートした。
Result: 操作が無事に完了した。
Date: 26/Mar/2024
Objective: JM109のコロニーを単離する。
Protocol:
プレートを回収し、コロニーが生えていることを確認した。
プレートを常温で保存した。
Result: 操作が無事に完了した。
Date: 26/Mar/2024
Objective: JM109のコンピテントセルを作製する。
Protocol:
25/Mar/2024に作製したプレートからシングルコロニーをピックし、25mLの液体LBに入れた。
37℃で8時間振盪培養した。
前培養液を2ml,4ml,10mlとり、それぞれ1Lフラスコの液体LB250ｍL に添加した。
18℃で一晩振盪培養した。
Result: 操作が無事に完了した。
Date: 27/Mar/2024
Objective: JM109のコンピテントセルを作製する。
Protocol: OD600をそれぞれの培養液に対して測定した。
Result: 失敗した。
Date: 10/Apr/2024
Objective: LB培地を作製する。
Protocol: “LB培地の作製”を参照。
Result: 操作が無事に完了した。
Date: 10/Apr/2024
Objective: JM109のコロニーを単離する。
Protocol:
JM109のコンピテントセルをごく少量とり、抗生物質を含まない固体のLB培地へ塗布した。
37℃で一晩インキュベートした。
Result: 操作が無事に完了した。
Date: 11/Apr/2024
Objective: JM109のコロニーを単離する。
Protocol:
プレートを回収し、コロニーが生えていることを確認した。
プレートを常温で保存した。
Result: 操作が無事に完了した。
Date: 11/Apr/2024
Objective: JM109のコンピテントセルを作製する。
Protocol:
10/Apr/2024に作製したプレートからシングルコロニーをピックし、25mLの液体LBに入れた。
37℃で8時間振盪培養した。
前培養液を200μl,400μl,1mlとり、それぞれ1Lフラスコの液体LB250ｍL に添加した。
18℃で一晩振盪培養した。
Result: 操作が無事に完了した。
Date: 12/Apr/2024
Objective: JM109のコンピテントセルを作製する。
Protocol:
OD600をそれぞれの培養液に対して測定した。
本培養液をフラスコごと氷水で10分間冷却した。
26/Feb/2024に調整したBuffer①と②を混ぜ合わせた。
冷却した大腸菌を4℃、2500gで10分間遠心分離し、上清を捨てた。
冷却しておいた80mLのInoue Bufferでペレットを懸濁した。
1.5mLのDMSOを添加し、混合した。
氷上で10分間インキュベートした。
サンプルを110μlずつエッペンに分注した。
エッペンごと液体窒素で凍結した。
-80℃で保管した。
Result: 操作が無事に完了した。
Date: 17/Apr/2024
Objective: コンピテントセル化した大腸菌のコンピテンシーを計測する。
Protocol:
110μlのJM109コンピテントセルを解凍した。
10pg/μl, 100pg/μl, 500pg/μlの3種類の濃度のpET28aベクター溶液を1μl添加した。
氷上で5分間インキュベートした。
42℃で45秒間ヒートショックした。
氷上で2分間インキュベートした。
500μlの液体LB(抗生物質無し)を添加した。
37℃で1時間インキュベートした。
回復培養させたサンプル611μlのうち、200μlをプレートに植菌した。
37℃で一晩インキュベートした。
Result: 操作が無事に完了した。
Date: 18/Apr/2024
Objective: コンピテントセル化した大腸菌のコンピテンシーを計測する。
Protocol:
プレートを回収した。
10pg/μl, 100pg/μl, 500μlのそれぞれの濃度のベクター溶液でいくつのコロニーが生えているかをカウントした。10pg/μl 0個、100pg/μl 56個、500pg/μl TMTC
ベクター溶液の濃度が100pg/μlの結果を用いてコンピテンシーを計算した。
Result: 操作が無事に完了した。計算結果は1.71×10^6[cfu/μg]であった。
Date: 30/May/2024
Objective: JM109の形質転換をする。
Protocol: “形質転換”を参照。ただし、ベクター溶液はpET28aで濃度は124ng/μl。
Result: 操作が無事に完了した。
Date: 31/May/2024
Objective: JM109の形質転換をする。
Protocol: “形質転換”を参照。
Result: 操作が無事に完了した。
Date: 03/Jun/2024
Objective: ベクターの抽出をする。
Protocol: “ベクターの抽出1”を参照。
Result: 操作が無事に完了した。
Date: 04/Jun/2024
Objective: ベクターの抽出をする。
Protocol: “ベクターの抽出1”を参照。
Result: 操作が無事に完了した。
Date: 15/Jul/2024
Objective: NcoⅠ処理とDNA抽出をする。
Protocol: タカラバイオのNcoⅠ標準プロトコールに従ってpET28aの制限酵素処理を行った。ただしインキュベートは2時間。
Result: 操作が無事に完了した。
Date: 17/Jul/2024
Objective: 形質転換する。
Protocol: “In-Fusion”と”形質転換”を参照。サンプルはavGFP。
Result: 操作が無事に完了した。形質転換に成功した。
Date: 18/Jul/2024
Objective: 形質転換する。
Protocol: “形質転換”を参照。サンプルはavGFP。
Result: 失敗。
Date: 18/Jul/2024
Objective: ゲルを作製する。
Protocol:
30mlのTAEバッファーに0.5gのアガロースを添加した。
電子レンジで加熱して、アガロースを溶解させた。
20mLのTAEバッファーを添加し、溶液をさました。
5μlの染色液を添加し、混和した。
型に流して固まるまで待った。
4℃で保存した。
Result: 操作が無事に完了した。
Date: 18/Jul/2024
Objective: pET28aのNco1処理をする。
Protocol: タカラバイオのNcoⅠ標準プロトコールに従ってpET28aの制限酵素処理を行った。ただしインキュベートは2時間。
Result: 操作が無事に完了した。
Date: 19/Jul/2024
Objective: pET28aのNco1処理をする。
Protocol:
1%アガロースゲルにサンプルとコントロールをアプライした。
100Vで20分間の電気泳動をした。
UVで露光した。
サンプルのレーンの最も太いバンドを切りだした。
4℃で保存した。
Result: 操作が無事に完了した。
Date: 24/Jul/2024
Objective: PCRする。
Protocol:
1．PrimeStar Max DNA Polymeraseを用いて以下の反応液を調製した。
| Prime Star | 25μl |
| Template | 2μl |
| Primer① | 1μl |
| Primer② | 1μl |
| MilliQ | 21μl |
| total | 50μl |
ただし、テンプレートはEGFPとavGFP、Primer①はigem_1_F, Primer②はigem_1_R
サーマルサイクラーによりPCRを行った。
5μlの10×Loading Bufferを添加した。
1%アガロースゲルにサンプルをアプライした。
100Vで20分間電気泳動した。
UVで露光しながらGFPの塩基対数の場所に現れたバンドを切りだした。
Result: 操作が無事に完了した。
Date: 24/Jul/2024
Objective: PCRする。
Protocol:
7/19に切りだしたpET28aのNcoⅠ処理のバンドのゲルと本日切りだしたavGFPとEGFPのバンドのゲルを用意し常温に戻した。
Fast Gene Gel/PCR Extraction Kitのプロトコールに従って実験を行った。
抽出したDNAは4℃で保管した。
Result: 操作が無事に完了した。
Date: 25/Jul/2024
Objective: 形質転換する。
Protocol: “In-Fusion”と”形質転換”を参照。サンプルはavGFP,EGFP。
Result: 操作が無事に完了した。
Date: 26/Jul/2024
Objective: 形質転換する。
Protocol: “形質転換”を参照。サンプルはavGFP。
Result: 失敗。
Date: 25/Jul/2024
Objective: 形質転換する。
Protocol: “In-Fusion”と”形質転換”を参照。サンプルはavGFP,EGFP。
Result: 操作が無事に完了した。
Date: 26/Jul/2024
Objective: 形質転換する。
Protocol: “形質転換”を参照。サンプルはavGFP,EGFP。
Result: 失敗。
Date: 29/Jul/2024
Objective: JM109の形質転換をする。
Protocol: “形質転換”を参照。ただし、ベクター溶液はpET28a。
Result: 操作が無事に完了した。
Date: 30/Jul/2024
Objective: JM109の形質転換をする。
Protocol: “形質転換”を参照。
Result: 操作が無事に完了した。形質転換は成功した。
Date: 31/Jul/2024
Objective: ベクターの抽出をする。
Protocol: “ベクターの抽出1”を参照。
Result: 操作が無事に完了した。
Date: 01/Aug/2024
Objective: ベクターの抽出をする。
Protocol: “ベクターの抽出1”を参照。
Result: 操作が無事に完了した。
Date: 13/Aug/2024
Objective: pET28aのNco1処理をする。
Protocol: タカラバイオのNcoⅠ標準プロトコールに従ってpET28aの制限酵素処理を行った。ただしインキュベートは2時間。
Result: 操作が無事に完了した。
Date: 14/Aug/2024
Objective: pET28aのNco1処理をする。
Protocol:
1%アガロースゲルにサンプルとコントロールをアプライした。
100Vで20分間の電気泳動をした。
UVで露光した。
サンプルのレーンの最も太いバンドを切りだした。
Fast Gene Gel/PCR Extraction Kitのプロトコールに従って実験を行った。
4℃で保存した。
Result: 操作が無事に完了した。
Date: 15/Aug/2024
Objective: 形質転換する。
Protocol: “In-Fusion”と”形質転換”を参照。サンプルは13/Aug/2024にPCRで増幅したavGFPを用いた。
Result: 操作が無事に完了した。
Date: 16/Aug/2024
Objective: 形質転換する。
Protocol: “形質転換”を参照。
Result: 失敗。
Date: 03/Sep/2024
Objective: JM109の形質転換をする。
Protocol: “形質転換”を参照。ただし、ベクター溶液はpET28a。
Result: 操作が無事に完了した。
Date: 04/Sep/2024
Objective: JM109の形質転換をする。
Protocol: “形質転換”を参照。
Result: 操作が無事に完了した。形質転換は成功した。
Date: 04/Sep/2024
Objective: ベクターの抽出をする。
Protocol: “ベクターの抽出1”を参照。
Result: 操作が無事に完了した。
Date: 05/Sep/2024
Objective: ベクターの抽出をする。
Protocol: “ベクターの抽出1”を参照。
Result: 操作が無事に完了した。
Date: 06/Sep/2024
Objective: pET28aのNco1処理をする。
Protocol: タカラバイオのNcoⅠ標準プロトコールに従ってpET28aの制限酵素処理を行った。ただしインキュベートは2時間。
Result: 操作が無事に完了した。
Date: 07/Sep/2024
Objective: pET28aのNco1処理をする。
Protocol:
1%アガロースゲルにサンプルとコントロールをアプライした。
100Vで20分間の電気泳動をした。
UVで露光した。
サンプルのレーンの最も太いバンドを切りだした。
4℃で保存した。
Result: 操作が無事に完了した。
Date: 17/Sep/2024
Objective: 形質転換する。
Protocol: “In-Fusion”と”形質転換”を参照。サンプルは13/Aug/2024にPCRで増幅したavGFPを用いた。
Result: 操作が無事に完了した。
Date: 18/Sep/2024
Objective: 形質転換する。
Protocol: “形質転換”を参照。
Result: 失敗。
Date: 24/Sep/2024
Objective: コロニーを単離する。
Protocol:
BL21のコンピテントセルをごく少量とり、抗生物質を含まない固体のLB培地へ塗布した。
37℃で一晩インキュベートした。
Result: 操作が無事に完了した。
Date: 25/Sep/2024
Objective: コロニーを単離する。
Protocol:
プレートを回収し、コロニーが生えていることを確認した。
プレートを常温で保存した。
Result: 操作が無事に完了した。
Date: 25/Sep/2024
Objective: コンピテントセルを作製する。
Protocol:
25/Sep/2024に作製したプレートからシングルコロニーをピックし、25mLの液体LBに入れた。
37℃で8時間振盪培養した。
Result: 操作が無事に完了した。
Date: 12/Mar/2025
Objective: LB培地を作製する。
Protocol: “LB培地の作製”を参照。
Result: 操作が無事に完了した。
Date: 12/Mar/2025
Objective: 形質転換をする。
Protocol: “In-Fusion”と”形質転換”を参照。インサートとしてT01_Seq01~04を用いた。
Result: ここまでの操作を問題なく終了した**。**
Date: 14/Mar/2025
Objective: 形質転換をする。
Protocol: “形質転換”を参照。
Result: コロニーを確認し、プレートを常温で保管した。
Date: 14/Mar/2025
Objective: PCRする。
Protocol: 24/Jul/2024と同じ手順で実験を行った。ただし、テンプレートはpET28a、Primer①igem_3_F, Primer②igem_5_Rを用いた。
Result: ここまでの操作を問題なく終了した**。**
Fig. 1. 泳動結果
Date: 16/Mar/2025
Objective: 形質転換をする。
Protocol: “In-Fusion”と”形質転換”を参照。インサートとしてT01_Seq01~04, T02_01~29を用いた。
Result: ここまでの操作を問題なく終了した**。**
Date: 14/Mar/2025
Objective: 形質転換をする。
Protocol: “形質転換”を参照。
Result: コロニーを確認し、成功しているプレートを常温で保管した。
Date: 17/Mar/2025
Objective: JM109の形質転換をする。
Protocol: “形質転換”を参照。ただし、ベクター溶液はpET28a。
Result: 操作が無事に完了した。
Date: 18/Mar/2025
Objective: JM109の形質転換をする。
Protocol: “形質転換”を参照。
Result: 操作が無事に完了した。
Date: 18/Mar/2025
Objective: pET28aのNco1処理をする。
Protocol:
タカラバイオのNcoⅠ標準プロトコールに従って溶液を2つ調製した。ただしインキュベートは1つは1時間、もうひとつは2時間。
1%アガロースゲルにサンプルとコントロールをアプライした。
100Vで20分間の電気泳動をした。
UVで露光し写真撮影した。
Result: 1時間インキュベートしたサンプルが消えてしまった。
Fig. 2. 泳動結果
Date: 18/Mar/2025
Objective: pET28aのNco1処理をする。
Protocol:
タカラバイオのNcoⅠ標準プロトコールに従って溶液を2つ調製した。ただしインキュベートは1つは2時間、もうひとつは37℃で4時間。
1%アガロースゲルにサンプルとコントロールをアプライした。
100Vで20分間の電気泳動をした。
UVで露光し写真撮影した。
Result: 操作が無事に完了した。
Fig. 3. 泳動結果
Date: 22/Mar/2025
Objective: pET28aのNco1処理をする。
Protocol:
| NcoⅠ | 1μl |
| 10×K Buffer | 2μl |
| 0.1% BSA | 2μl |
| pET28a | 7μl |
| Nucease free water | 8μl |
37℃で2時間インキュベートした。
コントロールを調製した。
| pET28a | 7μl |
| Nucease free water | 13μl |
コントロールとサンプルの両方にそれぞれ2μlの10×Loading Bufferを添加した。
1%アガロースゲルにサンプルとコントロールをアプライした。
100Vで20分間の電気泳動をした。
UVで露光し写真撮影した。
Result: バンドが消えてしまった。
Fig. 4. 泳動結果
Date: 22/Mar/2025
Objective: pET28aのNco1処理をする。
Protocol: 22/Mar/2025と同じ手順で実験を行った。ただし、サンプル溶液を２つつくり、片方は2時間インキュベート、もう一つは4時間インキュベートした。
Result: 同様の手順で再度実験を行い、サンプルの回収まで行ったが時間が経ちすぎてしまい後日廃棄した。
Fig. 5. 泳動結果
Date: 22/Mar/2025
Objective: ベクターの抽出をする。
Protocol: “ベクターの抽出1”を参照。
Result: 操作が無事に完了した。
Date: 23/Mar/2025
Objective: ベクターの抽出をする。
Protocol: “ベクターの抽出1”を参照。
Result: 操作が無事に完了した。
Date: 23/Mar/2025
Objective: pET28aのNco1処理をする。
Protocol: 22/Mar/2025と同じ手順で実験を行った。ただし、pET28a溶液は当日抽出したものを用いた。
Result: 操作が無事に完了した。
Fig. 6. 泳動結果
Date: 23/Mar/2025
Objective: pET28aのNco1処理をする。
Protocol: 22/Mar/2025と同じ手順で実験を行った。ただし、Nucease free waterを使用せず、pET28aを15μl用いた。
Result: 失敗した。
Fig. 7. 泳動結果
Date: 23/Mar/2025
Objective: pET28aのNco1処理をする。
Protocol: 23/Mar/2025と同じ手順で実験を行った。
Result: 成功した。
Fig. 8. 泳動結果
Date: 23/Mar/2025
Objective: pET28aのNco1処理をする。
Protocol: 27/Mar/2025と同じ手順で実験を行った。ただし、スケールを5倍にして実験を行った。
Result: 成功した。
Fig. 9. 泳動結果
Date: 27/Mar/2025
Objective: 形質転換をする。
Protocol: “In-Fusion”と”形質転換”を参照。インサートとしてT01_Seq03, T02_01~03を用いた。
Result: ここまでの操作を問題なく終了した**。**
Date: 28/Mar/2025
Objective: 形質転換をする。
Protocol: “形質転換”を参照。
Result: コロニーを確認し、プレートを常温で保管した。
Date: 28/Mar/2025
Objective: コロニーPCRをする。
Protocol: “コロニーPCR”と”ベクターの抽出1”を参照。抽出にはレーン2,3,6,7,10,11のコロニーを用いた。
Result: ここまでの操作を問題なく終了した**。**
Fig. 10. 泳動結果
Date: 29/Mar/2025
Objective: 形質転換をする。
Protocol: “In-Fusion”と”形質転換”を参照。インサートとしてT01_Seq02,04, T02_04~29を用いた。
Result: ここまでの操作を問題なく終了した**。**
Date: 30/Mar/2025
Objective: 形質転換をする。
Protocol: “形質転換”を参照。
Result: コロニーを確認し、プレートを常温で保管した。
Date: 30/Mar/2025
Objective: コロニーPCRをする。
Protocol: “コロニーPCR”を参照。各レーンのコロニーをピックし、マスタープレートに植菌した。
Result: ここまでの操作を問題なく終了した**。**
Fig. 11. 泳動結果
Fig. 12. 泳動結果
Fig. 13. 泳動結果
Fig. 14. 泳動結果
Date: 31/Mar/2025
Objective: ベクターの抽出をする。
Protocol: “ベクターの抽出1”を参照。サンプルは各T01,T02シリーズのうちコロニーが生えたものを2コロニーずつ、1コロニーしか得られなかったものは1つだけ使用した。
Result: ここまでの操作を問題なく終了した**。**
Date: 02/Apr/2025
Objective: 形質転換をする。
Protocol: “In-Fusion”と”形質転換”を参照。インサートとしてT02_10,18,22,25,27を用いた。
Result: ここまでの操作を問題なく終了した**。**
Date: 03/Apr/2025
Objective: 形質転換をする。
Protocol: “形質転換”を参照。
Result: コロニーを確認できなかったためプレートは廃棄した。
Date: 03/Apr/2025
Objective: プラスミド抽出する。
Protocol: “ベクターの抽出1”を参照。
Result: ここまでの操作を問題なく終了した**。**
Date: 08/Apr/2025
Objective: コンピテントセル作製する。
Protocol:
SOB培地（×2）
| Tryptone | 2g×2 |
| Yeast extract | 0.5g×2 |
| 5M NaCl | 200μl×2 |
| 2M KCl | 125μl×2 |
| Dw水 | 98~100mL×2 |
| total | 100mL×2 |
混合後オートクレーブした。1M MgSO4を1mL(オートクレーブ済み)×2、1M MgCl2を1mL(オートクレーブ済み)×2用意した。
Transformation buffer(TB)ストック
| PIPES | 1.5g |
| CaCl2・2H2O | 1.1g |
| KCl | 9.3g |
| total | 500mL |
400mLのMilliQ水に懸濁ご、5M KOHでpH6.7~6.8に調整した。
MnCl2・4H2Oを5.45g添加し、500mLにメスアップし、フィルター過滅菌した。
Result: ここまでの操作を問題なく終了した**。**
Date: 08/Apr/2025
Objective: コンピテントセル作製する。
Protocol:
－80℃から取り出した大腸菌をLB寒天培地にストリークし、37℃で一晩培養した。
コロニーをSOB培地に移した。
シェーカーで激しく振盪し、18~22℃で培養した。
OD600=0.4~0.8に達したら培養を止め直ちに氷中にて10分間冷却した。
培養液を複数の50mLの遠沈管×２に移し、4℃で3000rpm、15分間遠心した。
上清を除いたあと、計30mLの氷冷TBに懸濁し、1本の50mLの遠沈管にまとめ、さらに氷中で10分間冷却した。
4℃で3000rpm、15分間遠心した。
上清を除いた後、8mLの氷冷TBに懸濁し、15mLの遠沈管に移し、さらに0.6mLのDMSO(最終濃度7％)を添加し、氷中で10分間冷却した。
100μlずつ1.5mLチューブに分注し、直ちに液体窒素に浸し凍結させた。
－80℃で保存した。
Result: コンピテントセルが完成した。
Date: 02/Jul/2025
Objective: BL21の形質転換をする。
Protocol: “形質転換”を参照。ただし、大腸菌はBL21株を用いた。
Result: 操作が無事に完了した。
Date: 03/Jul/2025
Objective: BL21の形質転換をする。
Protocol: “形質転換”を参照。
Result: コロニーが確認出来た。
Date: 03/Jul/2025
Objective: 形質転換をする。
Protocol: “形質転換”参照。ただし大腸菌はJM109を用いた。
Result: 操作が無事に完了した。
Date: 04/Jul/2025
Objective: 形質転換をする。
Protocol: “形質転換”を参照。
Result: コロニーを確認できなかったためプレートは廃棄した。
Date: 09/Jul/2024
Objective: LB培地を作製する。
Protocol: “LB培地の作製”を参照。
Result: 操作が無事に完了した。
Date: 10/Jul/2025
Objective: 形質転換をする。
Protocol: “形質転換”参照。ただし大腸菌はJM109を用いた。また、インサートにはavGFPを用いた。
Result: 操作が無事に完了した。
Date: 11/Jul/2025
Objective: 形質転換をする。
Protocol: “形質転換”を参照。
Result: コロニーを確認できた。
Date: 11/Jul/2025
Objective: コロニーPCRをする。
Protocol: “コロニーPCR”を参照。
Result: PCRできていなかった**。**
Date: 12/Jul/2025
Objective: コロニーPCRをする。
Protocol: “コロニーPCR”を参照。
Result: PCRできていなかった**。**
Date: 12/Jul/2025
Objective: 形質転換をする。
Protocol: 13/03/2025と同じ手順で、形質転換を行った。ただし、今回は、ベクターにpET28aを、インサートにavGFPとavGFP(PCRにより、増やしたもの）を用いた。
Result: ここまでの操作を問題なく終了した**。**
Date: 13/Jul/2025
Objective: 13/07/2025に形質転換を行なったプレートを確認する。
Protocol: “形質転換”を参照。
Result: プレートを回収し、コロニーを確認した。いずれのプレートにもコロニーが確認されたが、ネガティブコントロールのプレートの方がコロニーが多いように見受けられた。よって、JM109のコンピテンシーが悪いのかも、確認することにした。
Date: 13/Jul/2025
Objective: JM109のコンピテンシーを確認するために形質転換をする。
Protocol: 26/07/2024と同じ手順で実験を行った。ただし、各インサートを1.5μl、ベクター溶液0.5μlとし、目的サンプルのインサートにはavGFPを用いた。
Result: ここまでの操作を問題無く終了した。
Date: 14/Jul/2025
Objective: 13/07/2025のコロニープレートを確認する。
Protocol: “形質転換”を参照。
Result: コロニーは、ネガティブコントロール、avGFPでは１つ、ポジティブコントロールでは０こであった。実験失敗。
Date: 14/Jul/2025
objective: コロニーPCRをする。
Protocol: 28/03/2025と同じ手順で実験を行った。この時、avGFPのサンプルでは４つ、ネガティブコントロールでは１つをPCRした。
Result: バンドが確認できなかった。
Date: 15/Jul/2025
Objective: 形質転換をする。
Protocol: 13/03/2025と同じ手順で実験を行った。ただし、今回はベクターがpET28a、インサートはavGFPとネガティブコントロールを用いた。また、コンピテントセルは院生さんからもらったJM109を使った。
**Result:**ここまでの操作を問題無く終了した。
**Date:**16/Jul/2025
**Objective:**プレートを確認する。
**Protocol:“**形質転換”を参照。
Result: コロニーが確認できた。
Date: 16/Jul/2025
**Objective:**コロニーPCRをする。
Protocol: 28/03/2025と同じ手順で実験を行った。
**Result:**バンドは検出されたが、濃度が低かった。よって、もう一度コロニーPCRをやり直すことにした。
Date: 16/Jul/2025
**Objective:**コロニーPCRをする。
Protocol: 28/03/2025と同じ手順で実験を行った。ただし、ゲルを穴が小さいものに変更した。また、コロニーをMilliQに溶かした懸濁液を1μl加え、その分MilliQの添加量を1μl減らした。
**Result:**実験は成功した。
Date: 16/Jul/2025
Objective: ベクターを抽出する。
Protocol: 31/03/2025と同じ手順で実験を行った。
Result: ここまでの操作を問題無く終了した。
Date: 17/Jul/2025
Objective: ベクターを抽出する。
Protocol: 01/04/2025と同じ手順で実験を行った。
Result: ここまでの操作を問題無く終了した。
Date: 18/Jul/2025
Objective: 溶液を調整する。
Protocol:
以下の濃度の物質をMilliQに入れ、溶液を調整した。
Table 15. バッファーの組成
| Tris-HCl | 20mM |
| NaCl | 150mM |
| EDTA | 5mM |
最終的に pH 7.8 に調整し、全量を 200 ml とした。
Result: 上記の表のように溶液の調整が完了した。よって、完成した溶液をメディウム瓶に入れて保存した。
Date: 18/Jul/2025
Objective: 形質転換をする。
Protocol: 13/03/2025のベクター溶液0.5mlにコンピテントセルを点火するところから同じ手順で実験を行った。
ただしベクター溶液は17/07/2025に抽出したものを使った。また、コンピテントセルはBL21株を用いた。
Result: ここまでの作業を問題なく終了した。
Date: 19/Jul/2025
Objective: プレートを確認する。
Protocol: “形質転換”を参照。
Result: コロニーが確認できた。
Date: 19/Jul/2025
Objective: 前培養をする。
Protocol: 17/07/2025に確認したプレートから１つずつコロニーをピックし、液体LBに植菌した。
Result: 前培養が完了した。
Date: 20/Jul/2025
Objective: タンパク質の抽出の準備をする。
Protocol:
前日に前培養した培養液を50ml、200mlとり、それぞれ10mlの50mg/mlカナマイシン入りのLB培地に植菌した。これを37℃で２時間振盪培養した。
ODを確認し、問題なかったため、各試験管に100 mMのIPTGストック溶液を100 µl添加し、28℃で一晩培養した。
Result: ここまでの作業を問題なく終了した。
Date: 21/Jul/2025
Objective: タンパク質の抽出をする。
Protocol:
サンプルを回収し、15mlの遠沈管へ全量うつした。
1800Gで2分間遠心分離し、上清を捨てた。
ペレットを回収し、冷凍庫で保管した。
Result: タンパク質の抽出が完了した。
Date: 21/Jul/2025
Objective: 形質転換をする。
Protocol: 13/03/2025と同じ手順で実験を行った。ただし、今回はベクターがpET28a、インサートはT02_01~02ネガティブコントロールを用いた。また、コンピテントセルは院生さんからもらったJM109を使った。
**Result:**ここまでの操作を問題無く終了した。
Date: 22/Jul/2025
Objective: プレートを確認する。
Protocol: “形質転換”のプロトコール参照。
Result: T02_01、ネガティブコントロール（emptyベクター）は成功した。よって冷蔵庫で保管した。T02_02については、失敗したため、後日再度実験を行うことにした。
Date: 22/Jul/2025
Objective: 形質転換をする。
Protocol: 13/03/2025と同じ手順で実験を行った。ただし、今回はベクターがpET28a、残量の多いインサート(T02_21,22,24,27,29)を選んで用いた。また、コンピテントセルは院生さんからもらったJM109を使った。
Result: ここまでの作業を問題なく終了した。
Date: 23/Jul/2025
Objective: プレートを確認する。
Protocol: “形質転換”のプロトコール参照。
Result: 全てのプレートでコロニーを確認できた。よって冷蔵庫で保管することにした。
Date: 23/Jul/2025
Objective: 形質転換をする。
Protocol: 22/07/2025と同じ手順で実験を行った。ただし、インサートはT02_02,10,16,18,25を用いた。
Result: ここまで作業を問題なく終了した。
Date: 24/Jul/2025
Objective: プレートを確認する。
Protocol: “形質転換”のプロトコール参照。
Result: T02_10以外の全てのプレートでコロニーが確認できた。
Date: 24/Jul/2025
Objective: 寒天プレートを作成する。
Protocol: 以前作成した固体LB培地を溶かし、プレートにした。
Result: ここまで作業を問題なく終了した。
Date: 28/Jul/2025
Objective: コロニーPCRをする。
Protocol:
コロニーをチップの先端でつつき、10mlのMilliQに懸濁した。そして、各インサートの配列ごとに4個のコロニーを懸濁した。ネガティブコントロールのコロニーは１つだけ移った。
以下のPCR反応液を必要分だけ用意
Table 16. 反応液の組成
| Primer (T7 promotor primer) | 0.1μl |
| 2×Gflex PCR Buffer | 2.5μl |
| Primer (T7 terminator primer) | 0.1μl |
| Tks Gflex DNA polymerase | 0.1μl |
| コロニー懸濁液 | 2.2μl |
| total | 5μl |
① 94℃ 10分間
② 98℃ 10秒間
③ 55℃ 15秒間
④ 68℃ 1分間
②〜④を35サイクル行う。
サンプルに１μlのLoading Buffer(×10)と４μlのMillilQ水を添加
1%アガロースゲルに５μlのマーカーと各サンプルの全量をアプライする。
100Vで30分間電気泳動する。
UVで露光して、写真撮影
各配列ごとにインサートが入っていたコロニー懸濁液を２つずつ選び、5μlの50mg/l カナマイシンを含む液体LBへ植菌する。
37℃で一晩振盪培養する。
Result: ここまでの操作を問題なく終了した。
Fig. 15. 泳動結果
1: マーカー 2~5: T02_Seq21 6~9: T02_Seq22 10~13: T02_Seq24 14~17: T02_Seq25
Fig. 16. 泳動結果
Fig. 16. 泳動結果
1: マーカー 2~5: T02_Seq27, 6~9: T02_Seq29, 10: empty 11: negative control
Date: 29/Jul/2025
Objective: コロニーPCRをする。
Protocol:
サンプルを回収する。
培養液を18.000gで遠心分離する。
上清を除去する。
大腸菌ペレットからFavorprepのプロトコルにしたがって、プラスミド抽出をする。
Result: DNAが抽出された。よって4℃で保存した。
Date: 30/Jul/2025
Objective: 形質転換をする。
Protocol: 18/07/2025と同様の手順で実験を行った。ただし、以前抽出したT02_04,05,06,08,09の形質転換を行った。
Result: ここまでの操作を問題なく終了した。
Date: 31/Jul/2025
Objective: プレートを確認する。
Protocol: “形質転換”のプロトコール参照。
Result: 全てのプレートでコロニーが見られた。よって冷蔵庫で保存することにした。
Date: 31/Jul/2025
Objective: 形質転換をする。
Protocol: 18/03/2025と同様の手順で実験を行った。ただし、ベクターは以前抽出したT02_11,12,13,14,15のものを用いた。
Result: ここまでの作業を問題なく終了した。
Date: 01/Aug/2025
Objective: プレートを確認する。
Protocol: “形質転換”のプロトコール参照。
Result: 全てのプレートでコロニーが見られた。
Date: 01/Aug/2025
Objective: 形質転換をする。
Protocol: 22/07/2025と同じ手順で実験を行った。ただしインサートにはT02_07,16を用いた。
Result: ここまでの操作を問題なく終了した。
Date: 01/Aug/2025
Objective: 前培養をする。
Protocol:
T02-16,21,4,25,29の４番のコロニー、T02_22の３番のコロニーをピックし、カナマイシン入り液体LB培地5mlに植菌した。
37℃で一晩振盪培養をした。
Result: ここまでの操作を問題なく終了した。
Date: 01/Aug/2025
Objective: 前培養をする。
Protocol:
BL21株で培養したT02_04,05,06,08,09,11,12,13,14,15のプレートから１番のコロニーをピックし、カナマインシン入り液体LOB培地５mlに植菌した。
37℃で一晩振盪培養をした。
Result: ここまでの操作を問題なく終了した。
Date: 02/Aug/2025
Objective: 形質転換をする。
Protocol: 13/03/2025と同じ手順で実験を行った。ただし、ベクターはpET28a、インサートはT02_07,16、ネガティブコントロールを用いた。また、コンピテントセルは院生さんからもらったJM109を用いた。
Result: 形質転換が完了した。
Date: 02/Aug/2025
Objective: タンパク質の発現誘導をする。
Protocol: 20/07/2025と同じ手順で実験を行った。
Result: ここまでの操作を問題なく終了した。
Date: 02/Aug/2025
Objective: ミニプレップをする。
Protocol:
01/08/2025に培養しておいたJm109 (pET28aT02_16,21,24,25,29)を18000gで遠心分離した。
29/07/2025と同じ手順でminiprepした。
Result: ここまでの操作を問題なく終了した。
Date: 03/Aug/2025
Objective: タンパク質ペレットを回収する。
Protocol: 昨日培養したサンプルを回収し、18000gで2分間遠心分離した。上清を捨て、タンパク質ペレットを回収したあと、冷蔵庫に移動した。
Result: ここまでの操作を問題なく終了した。
Date: 04/Aug/2025
Objective: 寒天プレートを作製する。
Protocol: 24/07/2025と同じ手順で実験した。
Result: ここまでの操作を問題なく終了した。
Date: 05/Aug/2025
Objective: タンパク質の抽出と精製をする。
Protocol:
1mlの超音波処理バッファーをペレットに入れ、よく懸濁した。そして、1.5mlチューブに移した。
超音波破砕機に４分間入れる。この際30秒破砕、30秒休みを繰り返す。
pH7.8の、0.3mlの５MのNaClおよび2.33mlの硫酸アンモニウムを上清に添加した。
懸濁液全体を1.2mlの96%エタノールを直ちに混和し、30秒激しく振盪した。
3000Gで7分間遠心した。
上層のエタノール層を回収し、15mlチューブへ
n-ブタノール（エタノール層の体積の４分の１の量）を加え、30秒激しく振盪した。
3000Gで7分間遠心した。
下層を回収し15mlチューブへ
回収した仮装の体積の４分の１の量の100％硫酸アンモニウムを加える。
2時間常温で静置した。
2000gで5分間遠心した。
上層の有機層と下層の水槽と除去し、界面の沈殿を回収した。
1mlの超音頭処理バッファーに懸濁、溶解した。
Result: タンパク質の抽出と精製が完了した。
Date: 06/Aug/2025
Objective: プライマーの溶液を調整する。
Protocol: iGEM13,15,16,17,18の乾燥プライマーにMilliQを加えて、100μMになるように溶解した。この際、iGEM7、13は50pmol/μlだったので50倍希釈して、1mMのストックを作った（1μl : 49μl）また、iGEM14,15,16,17,18(100μM)は10倍、1mMのiGEM7,13は100倍に希釈することで10μMのプライマー溶液(iGEM7,13~18)を100μlずつ作製した。
Result: 溶液の調整が完了した。
Date: 06/Aug/2025
Objective: インサート断片を増幅する。
Protocol:
以下の溶液を調整した。
Table 17. 反応液の組成
| Prime Star master mix | 25μl |
| インサート断片 | 0.5μl |
| プライマー（10μM）① | 1μl |
| プライマー（10μM）② | 1μl |
| MilliQ | 22.5μl |
| total | 50μl |
ただし、インサートとプライマーは以下の対応で混ぜた。
Table 18. インサートとプライマーの対応
| インサート | プライマー① | プライマー② |
| T01_02 | iGEM14 | iGEM7 |
| T01_03 | iGEM15 | iGEM7 |
| T01_04 | iGEM16 | iGEM17 |
| T02_03 | iGEM18 | iGEM7 |
| T02_10 | iGEM13 | iGEM7 |
サーマルサイクラーの設定を以下にしてPCRを行った。
Result: インサートの断片が増幅できた。
Date: 06/Aug/2025
Objective: アガロースゲルを作製する。
Protocol: 18/07/2025と同じ手順で作製した。
Result: アガロースゲルが作製できた。
Date: 06/Aug/2025
Objective: DNAを抽出する。
Protocol:
PCR反応液の５倍量（45μl×５=225μl)の①Buffer PBを加えて混ぜた。
カラムに移して12000rpm で30秒遠心したあと、濾液を捨てた。
700μlの②Buffer NWを加えて、12000rpmで30秒遠心し、濾液を捨てた。
空で12000rpmで1分間遠心して乾燥させた。
新しい1.5mlチューブに付け替えて、50μlの④BufferEBと加えた。
１分静置してから12000rpmで1分間延伸して回収した。
Result: DNA抽出が完了した。
Date: 06/Aug/2025
Objective: 電気泳動をする。
Protocol: 以下の溶液を調整した。
Table 19. 反応液の組成
| PCR反応液 | 5μl |
| 10×Loading | 1μl |
| MilliQ | 4μl |
| total | 10μl |
100Vで20分電気泳動した。
Result: 電気泳動が完了した。
Fig. 17. 泳動結果
Fig. 17. 泳動結果
1: マーカー 2: T01_02 3: T01_03 4: T01_04 5: T02_03 6: T02_10
Date: 06/Aug/2025
Objective: 形質転換をする。
Protocol: 13/03/2025と同じ手順で実験を行った。ただし、ベクターはpET28a、インサートはT01_-04、ネガティブコントロールを用いた。また、コンピテントセルは院生さんからもらったJM109を用いた。
Result: 翌日、コロニーが１つしか確認できなかった。
Date: 07/Aug/2025
Objective: プライマー溶液の調整をする。
Protocol: igem_7,13,14,15,18のプライマーを全て10μMに調整した。
Result: 溶液の調整が完了した。
Date: 07/Aug/2025
Objective: インサートの断片を増幅する。
Protocol: 06/08/2025と同じ手順で実験を行った。ただしインサートはT01_02,03,T02_10を用いた。
Results: インサートの増幅が完了した。
Date: 07/Aug/2025
Objective: アガロースゲルを作製する。
Protocol: 06/08/2025と同じ手順で実験を行った。
Results: アガロースゲルの作製が完了した。
Date: 07/Aug/2025
Objective: DNA抽出をする。
Protocol: 06/08/2025と同じ手順で実験を行った。
Results: DNA抽出が完了した。
Date: 07/Aug/2025
Objective: 電気泳動をする。
Protocol: 06/08/2025と同じ手順で実験を行った。
Results: 電気泳動の結果、いずれも増幅が確認された。
Fig. 18. 泳動結果
Fig. 18. 泳動結果
1: マーカー 2: T01_02 3: T01_03 4: T02_10
Date: 07/Aug/2025
Objective: 形質転換をする。
Protocol: 22/07/2025と同じ手順で実験を行った。ただし、インサートはT01_02,03,04,T02_10を用いた。
Results: 形質転換が完了した。
Date: 08/Aug/2025
Objective: インサートの増幅をする。
Protocol: 06/08/2025と同じ手順でT02_03,T02_10の増幅を行った。ただし、T02_03は残量が0.5μlに満たなかったので、ある分を全て使った。
Results: インサートの増幅が完了した。
Date: 08/Aug/2025
Objective: アガロースゲルを作製する。
Protocol: 06/08/2025と同じ手順で実験を行った。
Results: アガロースゲルの作製が完了した。
Date: 08/Aug/2025
Objective: インサートの抽出をする。
Protocol: 06/08/2025と同じ手順でPCR反応液からインサート断片を抽出した。
Results: インサートが抽出できた。
Date: 08/Aug/2025
Objective: 電気泳動をする。
Protocol: 06/08/2025と同じ手順で実験を行った。
Results: 電気泳動が完了した。
Fig. 19. 泳動結果
Fig. 19. 泳動結果
1: マーカー 2: T02_03 3: T02_10
Date: 08/Aug/2025
Objective: 形質転換をする。
Protocol: 22/07/2025と同じ手順で実験を行った。
Results: 形質転換が完了した。
Date: 09/Aug/2025
Objective: コロニーPCRをする。
Protocol: 28/07/2025と同じ手順で実験を行った。ただし、インサートの種類はT01_02,T01_03,T01_04,T02_10の４つである。
Results: コロニーPCRが完了した。
Date: 09/Aug/2025
Objective: 使用したアガロースゲルをもう一度使う。
Protocol:
8枚分のゲルと三角フラスコに入れ、TAEバッファーを(2×8=16ml)加えた
アガロースゲルを電子レンジで溶かして、SYBRsafeを17ml加えた。
小さい方のコームでゲルを作製した。
Results: ここまでの操作を問題なく終了した。
Date: 09/Aug/2025
Objective: 電気泳動をする。
Protocol: 06/08/2025と同じ手順で実験を行った。
Results: ここまでの操作を問題なく終了した。
Date: 09/Aug/2025
Objective: コロニーPCRをする。
Protocol: 28/07/2025と同じ手順で実験を行った。ただしインサートの種類はT01_03の８つである。
Results: コロニーPCRが完了した。
Date: 09/Aug/2025
Objective: 植菌をする。
Protocol: T01_03の⑤と⑥を7.8μl、カナマイシン入りの培地5mlに入れて一晩振盪培養した。
Results: 植菌が完了した。
Date: 10/Aug/2025
Objective: ベクター抽出を行う。
Protocol:
培養液5mlを15mlチューブに移し替えた。
18000g、4℃、1分で遠心し、上清を捨てた。
250μlのFAPD1を加え、ピペッティングでペレットを完全に懸濁して、1.5 mlチューブに移した。
250μlのFAPD2bufferを加え、5~10回転倒混和し、透明になった。
150μlのFAPD3bufferを加え、直ちによく振って小さな沈殿ができていることを確認した。
18000g、4℃、10分で遠心し、上清をカラムに移した。
11000g、4℃、30秒で遠心し濾液を捨てた。
400μlのWFbufferを加え、11000g、4℃、30秒で遠心し、濾液を捨てた。
700μlのWashbufferを加え、11000g、4℃、30秒で遠心し、濾液を捨てた。
バッファーを加えてない状態で18000g、4℃、４分で遠心し、濾液を捨てた。
新しい1.5mlチューブに付け替え、75μlのElution bufferを膜に浸透させ、１分静置した。
18000g、4℃、１分で遠心し、ベクターを回収した。
DNA濃度をNanoDropで測定した。
Table 20. DNA濃度測定結果（コロニー別）
| コロニー番号 | インサート | 濃度(ng/μl) |
| 1 | T01_02 | 130 |
| 2 | T01_02 | 123 |
| 5 | T01_03 | 202 |
| 6 | T01_03 | 253 |
| 9 | T01_04 | 131 |
| 10 | T01_04 | 182 |
| 13 | T02_10 | 194 |
| 14 | T02_10 | 160 |
Results: 上記の表のようなDNA濃度になった。
Date: 11/Aug/2025
Objective: 形質転換をする。
Protocol:
18//07/2025と同様の手順で実験を行った。ただし、以前抽出したT02_10①,01②,02①,02②,22①,22②,T02_28をベクターとして用いた。
Results: 形質転換が完了した。
Date: 12/Aug/2025
Objective: 2%アガロースゲルの作製をする。
Protocol: 18/07/2025と同様の手順で実験を行った。ただし、バッファーは150ml、アガロースは3gを用いた。
Results: ここまでの操作を問題なく終了した。
Date: 12/Aug/2025
Objective: 植菌する。
Protocol: 5mlのカナマイシン入り培地に前日培養したサンプルを植菌した。
Results: 植菌が完了した。
Date: 13/Aug/2025
Objective: 本培養をする。
Protocol:
前日に前培養したサンプルから200μlとり、10mlのカナマイシン入り液体LBに植菌した。
2時間後OD600を測定し、十分であったので本培養をした。
100mMIPTGを100μlずつ添加し、28℃で一晩振盪培養した。
Results: ここまでの操作を問題なく終了した。
Date: 14/Aug/2025
Objective: 本培養をする。
Protocol: 培養液全量を15mlチューブに移し、18000Gで2分間遠心し上清を捨てた。
Result: 本培養が完了した。
Date: 21/Aug/2025
Objective: 形質転換をする。
Protocol: 13/03/2025と同じ手順で実験を行った。ただし、ベクターはpET28a、コンピテントセルはBL21株を用いた。また、インサートはT0_01,02,03,04,T02_01,04,07,08,10,13,14,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29を用いた。
Results: 形質転換が完了した。
Date: 25/Aug/2025
Objective: 形質転換をする。
Protocol: 以前抽出したT02_04,08,13,14,17,19,20,24,26,28のベクターを用いた。また、①、②があるものについては①の方を利用した。それ以外は18/07/2025と同様の手順で実験をこなった。
Result: ここまでの操作が問題なく終了した。
Date: 26/Aug/2025
Objective: プレートを確認する。
Protocol: “形質転換”を参照。
Result: プレートを回収し、コロニーが確認できた。よって、冷蔵庫で保管することにした。
Date: 26/Aug/2025
Objective: 前培養をする。
Protocol: 25/-8/2-25に形質転換したもののコロニーを各配列１つずつピックし、5mlの50mg/lのカナマイシン入り液体LB培地に植菌した。
Result: ここまでの操作が問題なく終了した。
Date: 27/Aug/2025
Objective: 本培養をする。
Protocol: 13/08/2025と同じ手順で実験を行った。
Result: ここまでの操作を問題なく終了した。
Date: 28/Aug/2025
Objective: 本培養をする。
Protocol: 培養液全量を15mlチューブに移し、18000Gで2分間遠心した。
Result: 本培養が完了した。
Date: 29/Aug/2025
Objective: 形質転換をする。
Protocol: 18/07/2025と同じ手順で実験を行った。ただし、T02_01①、21②、25①、29②のベクターを用いた。
Result: 本培養が完了した。
Date: 30/Aug/2025
Objective: 植菌をする。
Protocol: 5mlのカナマイシン入り培地に全開培養したサンプルを植菌した。
Result: 植菌が完了した。
Date: 30/Aug/2025
Objective: 本培養をする。
Protocol: 13/08/2025と同様に行った。
Result: ここまでの操作を問題なく終了した。
Date: 31/Aug/2025
Objective: 本培養をする。
Protocol: 培養液生産を15mlチューブに移し、18000gで2分間遠心した。そして、上清を除去した。
Result: 本培養が完了し、−4℃で保存することにした。
Date: 02/Sep/2025
Objective: タンパク質の抽出と精製をする。
Protocol: avGFPとT02_01で行った。05/08/2025と同じ手順で行った。また、T02_08,T02_28も行った。
Result: avGFPは失敗したが、他のものは成功した。
Date: 03/Sep/2025
Objective: SDS-PAGEを行う。
Protocol: “SDS-PAGE”のプロトコルを参照。avGFp、T02_01,08,28で行った。
Result: 全て単一のバンドが出た。
Date: 04/Sep/2025
Objective: 形質転換をする。
Protocol: 13/03/2025と同様の実験を行った。JM109株にpET28aのプラスミドを導入し、形質転換した。
Result: 形質転換が完了した。
Date: 04/Sep/2025
Objective: 検量線を作成する。
Protocol:
前日形質転換した大腸菌からコロニーを３つピックアップして450mlの
milliqに溶かした。
100mg/mlのアンピシリンを16倍,32倍,64倍,128倍,256倍,512倍に希釈したものを用意した。
プレートに大腸菌の懸濁液を200μl滴下したものを二つ用意した。
それぞれに16倍、32倍、64倍希釈のアンピシリンの区画と128倍、256倍、512倍希釈の区画をつくり滴下した。
上記のプレート2枚を37℃でインキュベートした。
Results: ここまでの操作を問題なく終了した。
Date: 06/Sep/2025
Objective: 濃度測定を行う。
Protocol: TakaRa Bradford Protein Assay kitの標準プロトコールの（1ml用）に従って実験を行った。ただしサンプルとしてT02_01,08,28(02/09/2025に精製したもの）を用いた。T02_008,28は２倍希釈して用いた。
Result: 濃度測定が完了した。
Date: 06/Sep/2025
Objective: 形質転換をする。
Protocol: 18/07/2025と同じ手順で実験を行った。ただし、T01_02,03,04,T02_02,10,16,18,22,24,27の各①、②のベクターを用いた。
Result: 形質転換が完了した。
Date: 07/Sep/2025
Objective: 植菌をする。
Protocol: 06/Sep/2025に形質転換したものを5mlのカナマイシン入り培地に植菌した。
Results: 植菌が完了した。
Date: 08/Sep/2025
Objective: 本培養をする。
Protocol: 07/Sep/2025に前培養したもの200mlを10mlのカナマイシン入り液体LB培地に植菌した。約２時間後、ODが十分になったので100μlの100mMのIPTGを添加、28℃で一晩培養した。
Results: 本培養が完了した。
Date: 09/Sep/2025
Objective: 本培養をする。
Protocol: 08/Sep/2025に本培養したものを18000Gで２分遠心し、上澄を捨てた。
Results: 植菌が完了した。
Date: 08/Sep/2025
Objective: 検量線を作成する。
Protocol: 04/Sep/2025に同様の手順で実験を行った。
Results: ここまでの操作が問題なく完了した。
Date: 08/Sep/2025
Objective: 検量線を作成する。
Protocol: 04/Sep/2025に同様の手順で実験を行った。
Results: ここまでの操作が問題なく完了した。
Date: 10/Sep/2025
Objective: SDS-PAGEを行う。
Protocol:
Table 21. 反応液の組成
| 精製済みタンパク質溶液 | 20μl |
| 5×Western Blotting buffer | 20μl |
| 1% SDS | 75μl |
| 2-Mercaptoethanol | 5μl |
上記の溶液を100℃に設定したヒートブロックで１０分追加した。
泳動槽に既製のゲルをセットし、泳動バッファーを入れた。
コームを外して、マーカー4μlと各サンプル20μlをレーンにアプライした。サンプルはT02_01,08,28を用いた。
ゲルを外し、DWを変えて、５分ずつ２回洗浄した。
CBB stainingをゲルが浸かるくらい入れ、１時間染色した。
染色液を捨て、DWを変えて５分ずつ２回洗浄した。
Results: SDS-PAGEが完了した。
Date: 10/Sep/2025
Objective: SDS-PAGEを行う。
Protocol: 10/Sep/2025と同様の手順で実験を行った。サンプルも同じものを用いた。
Results: SDS-PAGEが完了した。
Date: 11/Sep/2025
Objective: 前培養をする。
Protocol: 10/Sep/2025に形質転換したav-GFP入りの大腸菌を用いた。26/Aug/2025と同様の手順で実験を行った。
Results: 前培養が完了した。
Date: 12/Sep/2025
Objective: 本培養をする。
Protocol: 13/Aug/2025と同様の手順で実験を行った。ただし、サンプルはavGFPを用いた。
Results: 本培養が完了した。
Date: 13/Sep/2025
Objective: 本培養をする。
Protocol: 培養液全量を15mlチューブに移して、18000Gで２分遠心した。
Results: 本培養が完了した。
Date: 16/Sep/2025
Objective: タンパク質の精製をする。
Protocol: サンプルはT02_01,04,08,13,14,17,19,20,21,23,25,26,28,29とavGFPを用いた。それ以外は05/Aug/2025と同様の手順で実験を行った。
Results: 本培養が完了した。
Date: 17/Sep/2025
Objective: 蛍光、励起スペクトルの測定を行う。
Protocol: 16/Aug/2025に精製したサンプル：2M NaOH =1:1で混合し、吸光度を測定した。精製したサンプルのの蛍光および励起スペクトルをとった。（上記の混合サンプルとは別）
Results: 蛍光、励起スペクトルの測定が完了した。
Date: 18/Aug/2025
Objective: バッファーの調整を行う。
Protocol: 以下のbufferを各200mlずつ調整した。
Table 22. Binding Bufferの組成
| Tris-HCl (pH8) | 50mM |
| NaCl | 300mM |
| Imidazole | 5mM |
| mg(oac)2 | 20mM |
| Tween20 | 0.10% |
Table 23. Washing Bufferの組成
| Tris-HCl | 50mM |
| NaCl | 300mM |
| Imidazole | 5mM |
| Tween20 | 0.10% |
Table 24. Elution Bufferの組成
| Tris-HCl | 50mM |
| NaCl | 500mM |
| Imidazole | 400mM |
| Tween20 | 0.10% |
Results: 調整が完了した。また、調整したものを冷蔵庫で保管した。
Date: 19/Sep/2025
Objective: SDS-PAGEをする。
Protocol: 06/Sep/2025に精製したサンプルを用いた。それ以外は10/Sep/2025と同様の実験を行った。
Results: SDS-PAGEを完了した。
Date: 21/Sep/2025
Objective: 精製タンパク質の定量をする。
Protocol: 16/Sep/2025に精製したサンプルを用いた。TakaRa Bradford Protein Assay kitの標準プロトコールの（200μl用）に従って実験を行った。
Results: 精製タンパク質の定量を完了した。
Date: 21/Sep/2025
Objective: 前培養する。
Protocol: 26/Aug/2025と同様の手順で実験を行った。
Results: 前培養を完了した。
Date: 22/Sep/2025
Objective: 形質転換をする。
Protocol: T01の02,03,04とT02の01,040,08,13,14,17,19,20
Results: 形質転換を完了した。
Date: 22/Sep/2025
Objective: 本培養をする。
Protocol: 13/Aug/2025と同様の手順で実験を行った。
Results: ここまでの作業を問題なく完了した。
Date: 23/Sep/2025
**Objective:**本培養をする。
Protocol: 18000Gで2分間遠心し、上澄を捨てた。
Results: 本培養を完了した。
Date: 24/Sep/2025
Objective: DNA断片を増幅する。
Protocol:
プライマー溶液を10μMに調整した。
以下の溶液を調整した。
Table 25. 反応液の組成
| Prime Star Master mix | 25μl |
| インサート断片（テンプレート） | 1μl |
| プライマー①(濃度10mM) | 1μl |
| プライマー②(濃度10mM) | 1μl |
| MilliQ | 22μl |
| total | 50μl |
①94℃で2分間
②98℃で５秒間
③55℃で5秒間
④72℃で30秒間
⑤②〜④を35サイクル行う。
⑥20℃で保存
Results: 増幅を完了した。
Date: 25/Sep/2025
Objective: PCR産物の確認と精製をする。
Protocol: 確認のためのPCR産物5μl、10×Loading buffer 1μl、MilliQ4μl混合し、30分電気泳動した。シカジーニアスPCR&ゲルプレップキットのPCR産物用プロトコールに従って精製を行った。
Results: PCR産物の確認と精製が完了した。
Fig. 20. 泳動結果
Fig. 20. 泳動結果
左からマーカー、GFP、PETase、βラクタマーゼ
Date: 25/Sep/2025
Objective: タンパク質合成をする。
Protocol: “Purefrexによるタンパク質の合成”のプロトコール参照。
Results: タンパク質合成が完了した。
Date: 26/Sep/2025
Objective: 24/Sep/2025の実験のやり直しを行う。
Protocol: 24/Sep/2025と同様の手順で実験を行った。
Results: DNA断片の増幅が完了した。
Date: 26/Sep/2025
Objective: レジンの平衡化を行う。
Protocol:
100μlピペットマンでもピペッティングせずに1から2分レジンをかき混ぜた。
1分間優しく転倒混和した。
20 μlのレジン溶液をエッペンに分取した。
binding bufferを100 μl添加し、優しくピペッティングした。
700 gで2 分遠心して上清を除去した。
上記のbinding bufferの添加と上澄の除去の操作を4回繰り返した。
Results: レジンの平衡化が完了した。
Date: 27/Sep/2025
Objective: DNA断片の確認と抽出をする。
Protocol: 24/Sep/2025と同様の手順で実験を行った。
Results: バンドは見えなかった。
Fig. 21. 泳動結果
Fig. 22. 泳動結果
左からマーカー、PETase、GFP
Date: 28/Sep/2025
Objective: SDS-PAGEをする。
Protocol: サンプルはtotal,FT,W1,W2,W3,W4,W5,E1,E2,E3を用いた。それ以外は20/Sep/2025と同様の手順で実験を行った。
Results: DNA断片の増幅が完了した。
Date: 28/Sep/2025
Objective: 電気泳動をする。
Protocol: 27/Sep/2025に行ったPCRのPCR産物をサンプルとした。
Results: バンドは見えなかった。
Fig. 22. 泳動結果
Fig. 22. 泳動結果
左からマーカー、PETase
Date: 28/Sep/2025
Objective: 無細胞系のために27/Sep/2025のPCR産物を精製する。
Protocol: 無細胞系のために27/Sep/2025のPCR産物を精製した。シカジーニアスPCR＆ゲルプレップキットのPCR産物用プロトコールに従った。
Results: 精製が完了した。
Date: 29/Sep/2025
Objective: 無細胞系によってタンパク質を発現させる。
Protocol: “無細胞系によるタンパク質発現”プロトコール参照。PETaseを発現させた。
Results: 操作が完了した。
Date: 29/Sep/2025
Objective: レジンの平衡化を行う。
Protocol:
100μlピペットマンでもピペッティングせずに1から2分レジンをかき混ぜた。
1分間優しく転倒混和した。
20 μlのレジン溶液をエッペンに分取した。
binding bufferを100 μl添加し、優しくピペッティングした。
700 gで2 分遠心して上清を除去した。
上記のbinding bufferの添加と上澄の除去の操作を4回繰り返した。
Results: レジンの平衡化が完了した。
Date: 29/Sep/2025
Objective: Hisタグを用いてタンパク質の精製を行う。
Protocol: “Hisタグ精製”プロトコール参照。PETaseの精製を行った。
Results: avGFPの精製が完了した。
Date: 30/Sep/2025
Objective: Hisタグを用いてタンパク質の精製を行う。
Protocol: “Hisタグ精製”プロトコール参照。avGFPの精製を行った。
Results: avGFPの精製が完了した。
Date: 01/Oct/2025
Objective: 蛍光タンパク質の定量を行う。
Protocol: “蛍光タンパク質の定量”プロトコール参照。avGFPの定量を行った。
Results: 溶液の濃度が足りず上手く定量できなかった。
Date: 02/Oct/2025
Objective: 精製したタンパク質の確認をする。
Protocol: “SDS-PAGE”プロトコール参照。30/Sep/2025に精製したタンパク質のSDS-PAGEを行った。
Results: 問題無く操作を終了した。
Date: 02/Oct/2025
Objective: 培養した大腸菌ペレットからタンパク質を精製する。
Protocol: “タンパク質の抽出と精製”プロトコール参照。24/Sep/2025に回収したペレットの精製を行った。ただし、最後に1mLの超音波処理バッファーで懸濁する部分を200μlに変更した。
Results: 精製が完了した。
Date: 05/Oct/2025
Objective: タンパク質溶液の濃度の定量を行う。
Protocol: “Bradford法”プロトコール参照。02/Oct/2025に精製したサンプルを定量した。
Results: 定量が完了した。
Date: 05/Oct/2025
Objective: タンパク質発現のための前培養を行う。
Protocol: 22/Sep/2025に形質転換したプレートのうちT01_04からコロニーをピックし、5mLのカナマイシン入り液体LB培地に植菌した。
Results: 前培養が完了した。
Date: 06/Oct/2025
Objective: タンパク質発現のための本培養を行う。
Protocol: 13/Aug/2025と同様の手順で実験を行った。05/Oct/2025に前培養したT01_04サンプルを用いた。
Results: 本培養が完了した。
Date: 06/Sep/2025
Objective: 本培養をする。
Protocol: 18000Gで2分間遠心し、上澄を捨てた。
Results: 本培養を完了した。
Date: 05/Oct/2025
Objective: タンパク質発現のための前培養を行う。
Protocol: 22/Sep/2025に形質転換したプレートのうちT01_02, T02_19,20,21,23, avGFPからコロニーをピックし、5mLのカナマイシン入り液体LB培地に植菌した。
Results: 前培養が完了した。
Date: 06/Oct/2025
Objective: タンパク質発現のための本培養を行う。
Protocol: 13/Aug/2025と同様の手順で実験を行った。05/Oct/2025に前培養したT01_02, T02_19,20,21,23, avGFPサンプルを用いた。
Results: 本培養が完了した。
Date: 07/Oct/2025
Objective: 本培養をする。
Protocol: 18000Gで2分間遠心し、上澄を捨てた。
Results: 本培養を完了した。
Date: 06/Oct/2025
Objective: レジンの平衡化を行う。
Protocol:
100μlピペットマンでもピペッティングせずに1から2分レジンをかき混ぜた。
1分間優しく転倒混和した。
20 μlのレジン溶液をエッペンに分取した。
binding bufferを100 μl添加し、優しくピペッティングした。
700 gで2 分遠心して上清を除去した。
上記のbinding bufferの添加と上澄の除去の操作を4回繰り返した。
Results: レジンの平衡化が完了した。
Date: 06/Oct/2025
Objective: 無細胞系によってタンパク質を発現させる。
Protocol: “無細胞系によるタンパク質発現”プロトコール参照。T03_01~05を発現させた。
Results: 操作が完了した。
Date: 06/Oct/2025
Objective: Hisタグを用いてタンパク質の精製を行う。
Protocol: “Hisタグ精製”プロトコール参照。T03_01~05の精製を行った。
Results: T03_01~05の精製が完了した。
Date: 07/Oct/2025
Objective: 培養した大腸菌ペレットからタンパク質を精製する。
Protocol: “タンパク質の抽出と精製”プロトコール参照。T01_02,04, T02_19,20,21,23, avGFPの精製を行った。ただし、最後に1mLの超音波処理バッファーで懸濁する部分を200μlに変更した。
Results: 精製が完了した。
Date: 07/Oct/2025
Objective: タンパク質溶液の濃度の定量を行う。
Protocol: “Bradford法”プロトコール参照。07/Oct/2025に精製したサンプルを定量した。
Results: 定量が完了した。
Date: 07/Oct/2025
Objective: タンパク質溶液の濃度の定量を行う。
Protocol: “Bradford法”プロトコール参照。ただし、各サンプルを4μl, ここに加えるBradford Dye Reagentを200μlに変更している標準プロトコールに従った。06/Oct/2025に精製したサンプルを定量した。
Results: 定量が完了した。
Date: 07/Oct/2025
Objective: 蛍光、励起スペクトルの測定を行う。
Protocol: 07/Oct/2025に精製したサンプルのの蛍光および励起スペクトルをとった。
Results: 蛍光、励起スペクトルの測定が完了した。
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